表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）的突變輔助診斷，在酪氨酸激酶抑制劑靶向癌癥的治療中，被認(rèn)為具有至關(guān)重要的作用。有效識(shí)別少量的EGFR-突變細(xì)胞是當(dāng)前臨床治療的迫切需求。但是，這些突變細(xì)胞信號(hào)往往被大部分正常細(xì)胞的噪聲信號(hào)所掩蓋，妨礙了突變細(xì)胞的有效識(shí)別。

國(guó)家納米科學(xué)中心胡志遠(yuǎn)、魏澤文教授等人提出一種基于微流控芯片的方法，有效實(shí)現(xiàn)了EGFR的多重突變?cè)趩渭?xì)胞水平的檢測(cè)。利用微免疫熒光成像技術(shù)輕易識(shí)別出EGFR-表達(dá)細(xì)胞，這些單細(xì)胞被放置于特別設(shè)計(jì)的硅微米通道內(nèi)。同時(shí)，通過(guò)單細(xì)胞的原位裂解，對(duì)EFGR-表達(dá)細(xì)胞的分解物進(jìn)行進(jìn)一步監(jiān)測(cè)，避免交叉污染。這項(xiàng)研究證實(shí)，微流控芯片技術(shù)不僅可以檢測(cè)是否存在EFGR突變，而且能提供很多其他單細(xì)胞級(jí)別的信息：比如具體到哪個(gè)細(xì)胞發(fā)生突變，以及同一細(xì)胞是否存在多重突變等等。本研究提出的微流控芯片技術(shù)將推動(dòng)簡(jiǎn)便廉價(jià)的DNA Sanger測(cè)序成為腫瘤靶向治療前的常規(guī)測(cè)試。

文章發(fā)表于Nano-Micro Letters期刊2018年第10卷第1期，詳情請(qǐng)閱讀全文，可免費(fèi)獲取。文章題目：Identifying EGFR-Expressed Cells and Detecting EGFR MultiMutations at Single-Cell Level by Microfluidic Chip

關(guān)鍵詞：EFGR突變，單細(xì)胞分析，微流芯片，酪氨酸激酶抑制劑

引用信息：Ren Li . Mingxing Zhou . Jine Li . Zihua Wang . Weikai Zhang . Chunyan Yue. Yan Ma. Hailin Peng. Zewen Wei . Zhiyuan Hu, Nano-Micro Lett. (2018) 10: 14. https://doi.org/10.1007/s40820-017-0168-y

圖1：微流控芯片原理及其操作圖，a) 細(xì)胞混合物被吸入一個(gè)微流體芯片，它由三個(gè)層次組成：微流體通道、細(xì)胞捕獲陣列和細(xì)胞裂解物收集室。流速為3微升每分鐘；b) 細(xì)胞進(jìn)入微孔，方形微孔設(shè)計(jì)適合于只有一個(gè)細(xì)胞；c) 芯片熒光檢測(cè)特定蛋白符號(hào)的細(xì)胞；d) 藍(lán)色球代表陰性的細(xì)胞，呈現(xiàn)出只有DAPI藍(lán)色熒光，而綠色球代表陽(yáng)性細(xì)胞，表現(xiàn)出綠色FITC和DAPI藍(lán)色；e) 微孔的細(xì)胞裂解通過(guò)微流體通道輸入細(xì)胞裂解液，細(xì)胞裂解液直接作用于細(xì)胞裂解液收集室；f) 細(xì)胞裂解液分別從細(xì)胞裂解物收集室收集，用于DNA擴(kuò)增和測(cè)序。

為了清楚地顯示芯片結(jié)構(gòu)，示意圖不遵循精確的井?dāng)?shù)和尺寸。

圖2：微流控芯片的制作。a）由三層組成的微流控芯片的制作工藝，分別用數(shù)字1, 2和3表示, b）空硅微孔（左欄）和單細(xì)胞占據(jù)微孔（右列）的SEM圖像

圖3：細(xì)胞俘獲效率的優(yōu)化。捕獲細(xì)胞的效率被定義為捕獲的細(xì)胞與注入到微流控芯片中的所有細(xì)胞的比率。a)細(xì)胞捕獲效率和方形微孔的邊長(zhǎng)之間的關(guān)系。b)細(xì)胞捕獲效率與細(xì)胞捕獲時(shí)間的關(guān)系。c) 細(xì)胞捕獲效率和細(xì)胞密度的關(guān)系。d) 被困的單細(xì)胞用DAPI染色，呈現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)。

圖4：熒光識(shí)別、擴(kuò)增和測(cè)序MCF-7細(xì)胞。a)微孔細(xì)胞的熒光圖像，上面一排是包含兼有DAPI（藍(lán)色）和FITC（綠色）染色的MCF-7細(xì)胞的區(qū)域；中間一行只包含DAPI染色（藍(lán)色）的HEK-293T細(xì)胞；較低行包含HEK-293T細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞。b)瓊脂糖凝膠熒光圖像證實(shí)了STR結(jié)構(gòu)域的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物。左兩列空行和PBS的反應(yīng)作為陰性對(duì)照；第三、第四左柱從純HEK-293T和MCF-7細(xì)胞的產(chǎn)品，無(wú)切屑加工，作為陽(yáng)性對(duì)照。三右列依次是不含細(xì)胞，只有HEK-293T細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞的芯片產(chǎn)品。c)STR域測(cè)序結(jié)果的從細(xì)胞裂解物的區(qū)域到分別只包含HEK-293T和MCF-7細(xì)胞的區(qū)域。

圖5：檢測(cè)EGFR多突變。a)微孔細(xì)胞的熒光圖像,上面一排是只包含兼有DAPI（藍(lán)色）和FITC（綠色）染色的EGFR信號(hào)細(xì)胞的區(qū)域；中間一行只包含DAPI染色（藍(lán)色）的HEK-293T細(xì)胞；較低的行包含HEK-293T細(xì)胞和表皮生長(zhǎng)因子受體表達(dá)的細(xì)胞。b)Sanger測(cè)序提供了準(zhǔn)確信息：在外顯子19，NICH1650細(xì)胞顯示缺失突變（Del E746-A750）；外顯子20，NCI-H1975細(xì)胞株顯示的點(diǎn)突變（T790M）；外顯子21，NICH1975細(xì)胞顯示點(diǎn)突變（L858R）。c)對(duì)于NCI-H1975細(xì)胞株，在外顯子20和21檢測(cè)到突變；對(duì)NICH1650細(xì)胞，在外顯子19檢測(cè)到突變。此外，在HEK-293T或A549細(xì)胞無(wú)假陽(yáng)性結(jié)果。

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