京都大學(xué)物質(zhì)-細(xì)胞綜合系統(tǒng)基地（iCeMS）的龜井謙一郎副教授和Rodi Abdalkader特定助教利用微細(xì)加工技術(shù)，成功開發(fā)了通過細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)再現(xiàn)人角膜結(jié)構(gòu)的器件。該研究結(jié)果有望用于眼藥水開發(fā)，還可作為所需的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的代替方案。

圖：研究示意圖（插圖：高宮泉水 iCeMS特定助教）

透明的眼角膜如果生病，會(huì)因渾濁等導(dǎo)致視覺障礙，有時(shí)甚至可能失明等。為治療這類疾病，人類開發(fā)了眼藥水等治療藥物，但利用兔子等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無法預(yù)測其對人的功效和毒性。不僅因?yàn)榕c實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之間存在物種差異，還因?yàn)檎Ｑ鄣念l率也不同。

所以，此次研究著眼于“微流體器件”，這種器件采用可加工非常小的微米級材料的微細(xì)加工技術(shù)。利用這種器件，可以再現(xiàn)人體中的血管網(wǎng)絡(luò)和組織。通過在該器件上培養(yǎng)人源角膜上皮細(xì)胞，并增減細(xì)胞培養(yǎng)液，成功開發(fā)出了可以再現(xiàn)眨眼動(dòng)作的“人角膜模型”。

此次取得的成果不僅能為開發(fā)新的角膜治療藥做出貢獻(xiàn)，還有望作為動(dòng)物代替方案，減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用。

背景

我們的生活中有很多“藥物”，藥是健康生活不可或缺的物品。開發(fā)一種新藥需要數(shù)百億日元以上的巨額費(fèi)用和10年以上的漫長時(shí)間。另外，并不是所有的藥品開發(fā)都能成功，還存在成功率非常低的課題。

其中，眼藥不僅能改善眼睛干燥和充血，還能治療眼部炎癥和眼病等。開發(fā)眼藥時(shí)要評估藥效、安全性和毒性等，但由于使用的是兔子等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，無法準(zhǔn)確進(jìn)行評價(jià)。尤其是兔子，每小時(shí)只“眨眼”10～12次，而人每小時(shí)眨眼1,000次，相差非常大，這是物種差異的原因之一。因此，亟需開發(fā)能再現(xiàn)人“眼”的新試驗(yàn)方法。

近年來，作為利用培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)的人體器官模型，采用基于微細(xì)加工技術(shù)的微流體器件的“Oran on a Chip（器官芯片）”受到關(guān)注（圖1）。這是在器件內(nèi)制作模擬組織結(jié)構(gòu)的模型的技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)利用以往的細(xì)胞培養(yǎng)板等無法再現(xiàn)的組織功能。在2016年的世界經(jīng)濟(jì)論壇上，器官芯片與新一代電池和自動(dòng)駕駛汽車等一同入選為“十大新興技術(shù)（Top 10 Emerging Technologies）”，其重要性與日俱增。

圖1：近年來開始受到關(guān)注的器官模型“Organ on a Chip（器官芯片）”
（出處：Huh et al., Lab Chip, 2012, 12, 2156）

研究內(nèi)容與成果

因此，為開發(fā)可以實(shí)施角膜藥物滲透試驗(yàn)和毒性試驗(yàn)的體外人體模型（圖2），研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了將人角膜上皮細(xì)胞引入微流體器件中的新實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)“角膜芯片”（圖3、4）。

圖2：此次研究再現(xiàn)的人角膜結(jié)構(gòu)和眨眼時(shí)的眼淚運(yùn)動(dòng)

圖3：此次研究開發(fā)的“角膜芯片”概念圖

圖4：角膜芯片

研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)該芯片有以下三個(gè)目的：①實(shí)施藥物的角膜上皮滲透性試驗(yàn)、②驗(yàn)證眨眼給角膜上皮細(xì)胞施加的剪切應(yīng)力、③通過剪切應(yīng)力提高角膜上皮的功能。首先，芯片的材料采用生物相容性高、透氣性和透光性也都比較高的聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane：PDMS）。另外，通過在微流體器件內(nèi)設(shè)置多孔膜，在上面培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞，可以評估角膜上皮細(xì)胞的成膜性和藥物滲透性。此外，為再現(xiàn)眨眼的剪切應(yīng)力，使用了可雙向驅(qū)動(dòng)的注射泵。

圖5：在角膜芯片內(nèi)培養(yǎng)的角膜上皮細(xì)胞的ZO-1蛋白質(zhì)（綠色）表達(dá)。角膜發(fā)揮作用需要ZO-1。與以往的方法（利用通透性嵌套（Transwell））相比，可以確認(rèn)表達(dá)量增加。左圖比例尺為50μm，右圖比例尺為100μm。

研究團(tuán)隊(duì)利用免疫細(xì)胞染色法確認(rèn)了在制作的芯片內(nèi)培養(yǎng)的人角膜上皮細(xì)胞（HCE-T）的膜功能（圖5）。可以確認(rèn)，發(fā)揮膜功能所需的ZO-1蛋白質(zhì)在培養(yǎng)的第7天強(qiáng)烈表達(dá)，另外還確認(rèn)，其表達(dá)比以前使用通透性嵌套的培養(yǎng)更強(qiáng)。

圖6：在角膜芯片內(nèi)培養(yǎng)的角膜上皮細(xì)胞中的CK-19蛋白質(zhì)（紅色）的表達(dá)。角膜成熟需要CK-19?？梢源_認(rèn)，與靜態(tài)培養(yǎng)相比，施加雙向剪切應(yīng)力的話，CK-19的表達(dá)會(huì)增加。比例尺為50μm。

接下來，利用免疫細(xì)胞染色法確認(rèn)了雙向剪切應(yīng)力對角膜上皮細(xì)胞成熟的影響（圖6）。經(jīng)確認(rèn)，隨著施加雙向剪切應(yīng)力，角膜成熟標(biāo)志物CK-19蛋白的表達(dá)增強(qiáng)。由此確認(rèn)，此次研究開發(fā)的“角膜芯片”能以功能更高的狀態(tài)培養(yǎng)角膜。

未來展望

此次研究成功開發(fā)了不僅是角膜結(jié)構(gòu)，還再現(xiàn)了眨眼動(dòng)作的體外人體模型“角膜芯片”。該芯片作為預(yù)測眼藥水的藥效、安全性和毒性對人體的影響的新方法備受期待，這些利用以往的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是難以實(shí)現(xiàn)的。

另外，作為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的代替方案也值得期待，有助于減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用。近年來，從動(dòng)物保護(hù)和倫理的角度出發(fā)，全球都在減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用，有時(shí)甚至?xí)故褂?。例如?/span>EU已經(jīng)禁止在化妝品開發(fā)中使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。像此次的研究這樣，迫切需要開發(fā)不使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，而是實(shí)現(xiàn)人體模型的技術(shù)。

論文信息
題目：Multi-corneal barriers-on-a-chip to recapitulate eye blinking shear stress forces
期刊：《Lab on a Chip》
DOI：10.1039/C9LC01256G

原文鏈接

文章來源: JST客觀日本編輯部 科學(xué)網(wǎng)科學(xué)網(wǎng)轉(zhuǎn)載僅供參考學(xué)習(xí)及傳遞有用信息，版權(quán)歸原作者所有，如侵犯權(quán)益，請聯(lián)系刪除