聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) ( polymerase chain reaction，PCR) 提出至今已有20年時間，期間PCR已發(fā)展成為分子生物學(xué)領(lǐng)域的一項關(guān)鍵技術(shù)和常規(guī)技術(shù)，極大地推動了生命科學(xué)各個領(lǐng)域的發(fā)展。

特別是90 年代后期，美國 ABI 公司推出的實時熒光定量PCR( real time PCR，qPCR) 技術(shù)及相關(guān)產(chǎn)品更是將PCR由體外合成及定性/半定量檢測技術(shù)發(fā)展成為一種高靈敏、高特異性和精確定量的基因分析技術(shù)。

盡管經(jīng)過十幾年時間的迅速發(fā)展，qPCR 技術(shù)已經(jīng)用于除外傷和營養(yǎng)缺乏癥外所有疾病的診斷；但是，在 PCR擴(kuò)增過程中影響其擴(kuò)增效率的因素有很多，不能保證在反應(yīng)過程中擴(kuò)增效率保持不變和實際樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品以及不同樣品之間的擴(kuò)增效率是相同的；由此導(dǎo)致其定量分析所依賴的基礎(chǔ)——循環(huán)閾值(CT)不是恒定不變的。

因此 qPCR 的定量只是“相對定量”，其準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性依然不能夠滿足分子生物學(xué)定量分析的要求。

20 世紀(jì)末，Vogelstein等提出數(shù)字PCR(digital PCR，dPCR) 的概念，通過將一個樣本分成幾十到幾萬份，分配到不同的反應(yīng)單元；每個單元包含一個或多個拷貝的目標(biāo)分子( DNA 模板) ，在每個反應(yīng)單元中分別對目標(biāo)分子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后對各個反應(yīng)單元的熒光信號進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

與 qPCR 不同的是，數(shù)字PCR不依賴于CT值，因此不受擴(kuò)增效率影響，擴(kuò)增結(jié)束后通過直接計數(shù)或泊松分布公式來計算每個反應(yīng)單元的平均濃度(含量)，能夠?qū)⒄`差控制在5%以內(nèi)，數(shù)字PCR 可以不需要對照標(biāo)準(zhǔn)樣品和標(biāo)準(zhǔn)曲線來實現(xiàn)絕對定量分析。

該技術(shù)提出至今雖然只有十幾年時間，但是由于其獨特的技術(shù)優(yōu)勢和應(yīng)用前景，使得其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展相當(dāng)迅速。

迄今為止，已有包括Fluidigm和 Bio-Rad等幾家公司相繼推出了數(shù)字 PCR 產(chǎn)品，并已經(jīng)應(yīng)用于單細(xì)胞分析、癌癥早期診斷和產(chǎn)前診斷等研究領(lǐng)域。

1 數(shù)字PCR技術(shù)的原理

數(shù)字PCR(也可稱單分子PCR) 一般包括兩部分內(nèi)容，即PCR擴(kuò)增和熒光信號分析。在PCR 擴(kuò)增階段，與傳統(tǒng)技術(shù)不同，數(shù)字PCR一般需要將樣品稀釋到單分子水平，并平均分配到幾十至幾萬個單元中進(jìn)行反應(yīng)。不同于qPCR 對每個循環(huán)進(jìn)行實時熒光測定的方法，數(shù)字 PCR 技術(shù)是在擴(kuò)增結(jié)束后對每個反應(yīng)單元的熒光信號進(jìn)行采集。最后通過直接計數(shù)或泊松分布公式計算得到樣品的原始濃度或含量。

最初 Vogelstein等提出的數(shù)字 PCR 是在96孔板中進(jìn)行的，DNA 模板被稀釋成大約平均每兩個孔內(nèi)有一個拷貝的濃度，在經(jīng)過優(yōu)化的實驗條件下進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。他們設(shè)計了兩種帶有不同熒光基團(tuán)的分子信標(biāo)探針分別與 PCR 產(chǎn)物雜交，其中一種探針可以與野生型和突變型兩種產(chǎn)物雜交，另一種探針只與野生型雜交，通過直接計數(shù)每個孔內(nèi)的熒光信號得到同一樣品中等位基因(或野生型與突變型) 的數(shù)目和比值，并利用統(tǒng)計學(xué)方法分析樣品間的顯著性差異。

目前的數(shù)字 PCR 技術(shù)主要采用分子信標(biāo)和TaqMan探針兩種方式對 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行熒光標(biāo)記。其中分子信標(biāo)法 通過一對通用引物得到包括野生型和突變型 在內(nèi)的 PCR 產(chǎn)物，再經(jīng)過不對稱 PCR( asymmetric PCR) 得到單鏈 DNA 分子與兩種熒光分子信標(biāo)分別雜交，利用熒光顏色區(qū)別野生型和突變型，通過具有不同熒光反應(yīng)單元數(shù)量的多少和比率進(jìn)行分析，這種方法也被稱為數(shù)字SNP( digital singlenucleotide polymorphism，digitalSNP) 。

TaqMan 探針法則可用于基因表達(dá)分析和單細(xì)胞多重 PCR等。Vogelstein 等提出一種基于磁珠和微乳液的固相數(shù)字 PCR 技術(shù)——BEAMing ( beads， emulsion，amplification，magnetics) 。

BEAMing 技術(shù)通過將引物化學(xué)鍵合在磁珠表面，再將單個磁珠與目標(biāo)分子包裹在微乳液滴中進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，將野生型和突變型目標(biāo)分子在磁珠表面進(jìn)行復(fù)制。擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行破乳，再利用流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行熒光計數(shù)。該技術(shù)還通過預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)，提高了系統(tǒng)的靈敏度，適合用于低概率的等位基因突變分析。

BEAMing 技術(shù)可通過固液分離除去多余熒光探針，降低背景干擾，可采用普通熒光探針代替高成本分子信標(biāo)和 TaqMan 探針，降低成本。但是該方法需要將單個目標(biāo)分子與單個磁珠包裹在同一液滴中，增加了操作的復(fù)雜性和難度，需要進(jìn)行大量條件優(yōu)化實驗。

此外， Zhong等提出通過調(diào)節(jié)熒光探針濃度實現(xiàn)多重PCR的技術(shù)，實現(xiàn)了SMA基因拷貝數(shù)變異和 c．815A＞G突變位點等五重PCR分析，突破了通常只有4個熒光通道的局限。

數(shù)字 PCR 技術(shù)原理:

 a) 數(shù)字 PCR 過程，第一步稀釋樣本分配至每個反應(yīng)單元進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，第二步熒光檢測；

b) 分子信標(biāo)基因突變分析原理；

c) BEAMing 檢測原理

2 定量分析方法

傳統(tǒng)的qPCR通常以循環(huán)閾值( cycle threshold，CT)為定量分析的基礎(chǔ)，認(rèn)為在指數(shù)擴(kuò)增的開始階段樣品間的細(xì)小誤差尚未放大且擴(kuò)增效率恒定。

對于一個 PCR 反應(yīng)，到達(dá)循環(huán)閾值時其中，N0 為初始模板的拷貝數(shù)，Nt 為第CT個循環(huán)時產(chǎn)物的拷貝數(shù)，E為擴(kuò)增效率。將上式兩邊取對數(shù)，得到對于一個特定的PCR反應(yīng)，擴(kuò)增效率E和CT個循環(huán)時的拷貝數(shù)Nt均為定值，因此，CT值與初始模板拷貝數(shù)N0的對數(shù)成反比關(guān)系。

然而，在PCR 擴(kuò)增過程當(dāng)中影響其擴(kuò)增效率的因素有很多，比如酶和引物濃度等，因此很難保證擴(kuò)增效率不變，導(dǎo)致定量PCR結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度難以保證。

與傳統(tǒng)qPCR方法不同的是數(shù)字PCR采用直接計數(shù)的方法進(jìn)行定量分析，也就是在PCR擴(kuò)增結(jié)束后有熒光信號(產(chǎn)物) 記為 1，無熒光信號(產(chǎn)物) 記為 0，有熒光信號的反應(yīng)單元中至少包含一個拷貝的目標(biāo)分子。

理論上，在樣品中的目標(biāo)DNA濃度極低的情況下，有熒光信號的反應(yīng)單元數(shù)目等于目標(biāo)DNA分子的拷貝數(shù)。

但是，在通常情況下，數(shù)字PCR的反應(yīng)單元中可能包含兩個或兩個以上的目標(biāo)分子，這時可以采用泊松概率分布公式( Poisson distribution) 進(jìn)行計算。

上式中λ為每個反應(yīng)單元中包含目標(biāo)DNA分子的平均拷貝數(shù)(濃度)，p為在一定的λ條件下，每個反應(yīng)單元中包含 k 拷貝目標(biāo) DNA 分子的概率。

λ由樣品溶液的稀釋系數(shù) m 決定，有 λ= cm，其中c為樣品的原始拷貝數(shù)(濃度) 。

當(dāng) k = 0 (不含目標(biāo) DNA 分子)時，上式可簡化為 p = e^－λ = e^－cm， p 可以看作是無熒光信號的反應(yīng)單元數(shù)與反應(yīng)單元總數(shù)的比值。

從數(shù)字 PCR 反應(yīng)單元總數(shù)和有熒光信號的單元數(shù)以及樣品的稀釋系數(shù)，就可以得到樣本的最初拷貝數(shù)(濃度) 。數(shù)字PCR的定量方法不依賴于擴(kuò)增曲線的循環(huán)閾值，因此不受擴(kuò)增效率的影響，也不必采用看家基因(house-keeping gene)和標(biāo)準(zhǔn)曲線，具有很好的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性，可以實現(xiàn)絕對定量分析。

數(shù)字 PCR 的靈敏度也可以稱之為分辨率，指的是對目標(biāo)基因或突變的識別能力。它除了與檢測器的靈敏度和PCR擴(kuò)增效率等因素有關(guān)外，很大程度上取決于反應(yīng)單元的數(shù)目n。

理論上每個反應(yīng)單元至多有一個拷貝的 DNA 分子，相同體積的情況下， n = 10^2 時，該方法的最大分辨率為1 /100，也就是說樣品濃度最低為1%可以被檢出。

如果 n = 10^4 時，就可以從10^4個分子中檢測到1個靶標(biāo)，即樣品濃度最低為 0. 01% 可以被檢出。因此，反應(yīng)單元的數(shù)目越多，數(shù)字PCR的靈敏度越高，準(zhǔn)確度也越高。

3 數(shù)字PCR技術(shù)分類

數(shù)字 PCR 技術(shù)提出至今，相關(guān)技術(shù)和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展都非常迅速。

迄今為止，數(shù)字 PCR 技術(shù)主要有三類: 微反應(yīng)室/孔板、大規(guī)模集成微流控芯片和液滴數(shù)字PCR系統(tǒng)。

微反應(yīng)室/孔板數(shù)字PCR

傳統(tǒng) PCR 或定量 PCR 反應(yīng)都是在96/384孔板中進(jìn)行的，因此早期的數(shù)字PCR技術(shù)也采用 96 /384孔板作為反應(yīng)單元。

但是數(shù)字PCR技術(shù)的靈敏度取決于反應(yīng)單元的總數(shù)n，因此，理論上反應(yīng)單元數(shù)越多越有利于提高靈敏度和準(zhǔn)確度，普通的96 /384孔板無法滿足檢測的需要。而且，在96 /384 孔板中進(jìn)行的PCR反應(yīng)體系通常大于5μl，由試劑消耗引起的高成本問題令人望而卻步。針對上述問題， Morrison 等在25mm×75mm不銹鋼芯片上刻蝕了3072個直徑為300μm的微反應(yīng)室(如圖2a所示)，每個反應(yīng)單元的體積降低至33 nl。該芯片可在商品化 PCR 儀上使用，與384 孔板的檢測靈敏度相當(dāng)，但反應(yīng)體積降低為原來的1/64，樣品通量提高了24倍。

隨著反應(yīng)單元數(shù)目的成倍增加，反應(yīng)體積從微升級降至納升級，傳統(tǒng)的操作人員采用移液器加試樣的方式已經(jīng)無法滿足快速精準(zhǔn)取樣的要求，因此需要借助高通量自動點樣儀或機(jī)械手等設(shè)備，這無疑大幅提高了系統(tǒng)的成本和操作的復(fù)雜性。

大規(guī)模集成流路數(shù)字PCR

微流控芯片技術(shù)的發(fā)展為我們提供了一個實現(xiàn)低成本、小體積和高通量平行PCR分析的理想平臺。

2000年，Unger等采用多層軟刻蝕 ( multilayer soft lithography，MSL) 技術(shù)在聚二甲基硅氧烷( polydimethylsiloxane，PDMS) 微流控芯片上設(shè)計并加工高密度微泵微閥結(jié)構(gòu)(如圖2b所示) ，他們將這種芯片稱為IFC( integrated fluidic circuit)。

IFC 利用PDMS材料具有高彈性的特點，通過多層軟刻蝕技術(shù)在芯片上加工交織的液體和氣體通道結(jié)構(gòu)，可以快速并準(zhǔn)確地將流體分成若干個獨立的單元，進(jìn)行多步平行反應(yīng)。

2006 年Ottesen等將IFC芯片用于數(shù)字PCR分析，通過精準(zhǔn)控制微泵微閥的開啟和關(guān)閉，一步操作即可將一個樣本平均分配到 1176個反應(yīng)單元中，每個反應(yīng)單元的體積只有6. 25 nl，成功代替了傳統(tǒng)點樣儀和384孔板。

他們同時進(jìn)行了6個樣本7 056個單元的平行數(shù)字PCR分析。此外， Hansen及其同事采用 MSL技術(shù)加工了具有10^6個結(jié)構(gòu)單元的數(shù)字PCR 芯片，每個反應(yīng)單元的體積降低至10 pl，芯片密度達(dá)到 440000 /cm2。

與微反應(yīng)室數(shù)字PCR系統(tǒng)相比，IFC的特點是通量更高，每個反應(yīng)單元的體積更小，加樣更快。最近，Men等在2mm×2mm區(qū)域內(nèi)加工了82000個 fl 級反應(yīng)單元，進(jìn)行數(shù)字PCR分析。

液滴數(shù)字PCR

液滴數(shù)字PCR源于乳液PCR( emulsion PCR) 技術(shù)，即將DNA模板與連接引物的磁性微球以極低的濃度(比如單拷貝) 包裹于油水兩相形成的納升至皮升級液滴中進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增后的產(chǎn)物富集在磁性微球上，收集破乳后進(jìn)行測序。

通過油水兩相間隔得到的以液滴為單位的 PCR 反應(yīng)體系，比微孔板和IFC 系統(tǒng)更容易實現(xiàn)小體積和高通量，而且系統(tǒng)簡單，成本低，因此成為理想的數(shù)字PCR技術(shù)平臺。

Vogelstein 及其同事提出的 BEAMing 技術(shù)就是一種基于乳液PCR的數(shù)字PCR系統(tǒng)。Lu 等也采用BEAMing 和連接酶反應(yīng)實現(xiàn)對 mRNA 的定量分析。Zhou 等在 BEAMingPCR 擴(kuò)增后破乳，將連接不同產(chǎn)物的磁珠包被在聚丙烯酰胺凝膠中制成磁珠陣列進(jìn)行熒光檢測。

但是，上述技術(shù)需要將單拷貝 DNA 模板與磁珠同時包裹在一個液滴中，增加了系統(tǒng)的復(fù)雜性和定量分析的難度。

Beer 等在微流控芯片通道中用油相包裹皮升級液滴，液滴中只包裹了單拷貝 DNA 模板、 PCR引物及試劑，實現(xiàn)了數(shù)字PCR 定量分析。

Hindson 等在微流控芯片中生成了20000—2000000個體積為 1nl 的液滴，然后將液滴轉(zhuǎn)移到 96 孔板中進(jìn)行TaqMan PCR擴(kuò)增，至終點后將液滴從 96 孔板中取出，在微流控芯片中采用流式方法使液滴順次經(jīng)過雙通道熒光檢測器，以1000個液滴/s的速度進(jìn)行計數(shù)。

Pekin 等設(shè)計了一種微流控芯片，可分別生成包含不同熒光探針和 DNA 模板的液滴，再進(jìn)行液滴融合，他們將該系統(tǒng)用于KRAS基因突變分析。

此外，Shen 等提出了一種通過滑動芯片( SlipChip) 液滴數(shù)字PCR系統(tǒng)，設(shè)計了帶有微流體通道和反應(yīng)單元的玻璃芯片，上下兩片之間用油相密封，通過滑動將樣品溶液從流體通道中引入反應(yīng)單元，同時生成1280個體積僅為2. 6 nl的液滴陣列，在芯片上進(jìn)行PCR擴(kuò)增和熒光成像分析。

隨后，他們還設(shè)計了具有不同體積反應(yīng)單元的 SlipChip，從1 nl變化到125nl，僅用不到 200個反應(yīng)單元，理論上可以實現(xiàn)12000個等體積反應(yīng)單元所能達(dá)到的檢測濃度范圍。

Yang 等還合成了凝膠微球作為反應(yīng)單元進(jìn)行數(shù)字 PCR 擴(kuò)增和定量分析，與前述液滴相比凝膠微球體系更加穩(wěn)定和可控，易于收集和保存擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖 2 幾種典型數(shù)字 PCR 芯片: a)微反應(yīng)室/孔板數(shù)字 PCR( OpenArrayTM); b)大規(guī)模集成微流控數(shù)字 PCR 芯片( BioMarkTM);c) 微液滴數(shù)字 PCR( QX100TM)

4 結(jié)論與展望

與傳統(tǒng)定量 PCR 不同，數(shù)字 PCR 通過直接計數(shù)的方法，可以實現(xiàn)起始 DNA 模板的絕對定量，因此特別適合用于CT值不能很好分辨的應(yīng)用領(lǐng)域，例如拷貝數(shù)變異、突變檢測、等位基因失衡和單細(xì)胞基因表達(dá)等。

對于這些低濃度樣品，檢測通量越高，可檢測到樣品信號的概率越大，靈敏度也就越高。近幾年數(shù)字 PCR 技術(shù)發(fā)展迅猛，新技術(shù)新方法不斷出現(xiàn)，全球各大公司對有前景的數(shù)字PCR技術(shù)競爭激烈，極大地推動了該領(lǐng)域的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。

2006 年美國 Fluidigm 公司率先推出第一款數(shù)字 PCR 產(chǎn)品——基于 IFC 技術(shù)的 BioMarkTM 系列高通量基因分析芯片系統(tǒng)，將數(shù)千個微泵微閥集成到芯片上，代替點樣儀可實現(xiàn)高通量加樣、加試劑、混合等操作，可同時進(jìn)行高37000個反應(yīng)。

微反應(yīng)室數(shù)字PCR系統(tǒng)以BioTrove 的OpenArrayTM為代表，他們用具有3072個微反應(yīng)室的芯片代替最初的96 /384孔板，大大提高了檢測通量，并且降低了反應(yīng)體積和試劑成本。

    2009 年，BioTrove被Life Technologies ( Applied Biosystems) 收購。

    2011 年Bio-Rad收購QuantaLife的液滴數(shù)字PCR 技術(shù)( ddPCR) ，迅速推出 QX100 液滴數(shù)字PCR產(chǎn)品，利用微流控芯片在油水兩相間生成約20000個液滴進(jìn)行高通量數(shù)字 PCR 分析。

最近，美國RainDance Technologies公司推出了RainDropTM數(shù)字 PCR 系統(tǒng)，可生成 100 萬個皮升級液滴，系統(tǒng)靈敏度大為提高。

可以說數(shù)字 PCR 是繼測序技術(shù)之后又一個擁有巨大潛力的新興技術(shù)和產(chǎn)業(yè)。

但是，目前的數(shù)字 PCR 技術(shù)仍然存在一些不足，制約了該技術(shù)廣泛應(yīng)用。例如，數(shù)字 PCR 自身特點決定了其分析的樣品通量很低，基本每塊芯片上萬個反應(yīng)單元都是針對單一樣本的分析。而熒光檢測技術(shù)的局限性限制了多個芯片的同時檢測，因此該技術(shù)目前在常規(guī)基因表達(dá)分析中不具備優(yōu)勢。

此外，數(shù)字PCR技術(shù)的靈敏度(分辨率) 和準(zhǔn)確性有待進(jìn)一步提高和優(yōu)化，在臨床診斷中需要進(jìn)行大量的比較和驗證實驗(對照傳統(tǒng)方法) 。

基于精密儀器和復(fù)雜芯片的數(shù)字 PCR 技術(shù)成本高昂，也是制約其廣泛應(yīng)用的一個原因。

相信在未來的幾年里將會不斷有新的技術(shù)和產(chǎn)品出現(xiàn)，不斷擴(kuò)展其應(yīng)用范圍，使之成為新一代分子診斷工具。