1.2 血細胞分離和采集

血細胞分離和采集是從全血中把某種特定類型的血細胞(如紅細胞、白細胞和血小板等)分離、純化并進行采集, 在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究以及血液疾病臨床診斷和治療中具有非常重要的作用。通過微流控芯片裝置可以對少量血樣快速、高效地檢測并分離出不同種類的血細胞。目前, 以微流控芯片為研究平臺的血細胞分離采集方法主要有2種:(1)以細胞微結(jié)構(gòu)和物理/力學(xué)特性為基礎(chǔ)的細胞被動分離; (2)通過在微流控通道中施加外加力場驅(qū)動細胞分離。

1.2.1 以血細胞微結(jié)構(gòu)和物理/力學(xué)特性為基礎(chǔ)的細胞分離

流體流動時, 在黏彈性效應(yīng)和慣性效應(yīng)作用下, 大顆粒將向靠近側(cè)壁的橫向位置遷移。類似地, 當血液在血管中流動時, 尺寸較小的柔性紅細胞將遷移至血管中間區(qū)域, 而尺寸較大的剛性白細胞及腫瘤細胞將向血管壁周圍遷移。利用這一特殊的血流動力學(xué)特征, 一些課題組設(shè)計了微流控芯片用于分離并采集不同類型的血細胞。例如, Liu等基于細胞物理特性和流體黏彈性效應(yīng)設(shè)計了一種微流控芯片, 不同大小的細胞在微流道內(nèi)流動至不同的通道:紅細胞匯聚在中間通道, 而腫瘤細胞在兩側(cè)通道內(nèi)富集[28], 成功實現(xiàn)了循環(huán)腫瘤細胞和紅細胞的完全分離。此外, 他們通過改變作用于囊泡的流體力, 成功實現(xiàn)了外泌體從胞外囊泡的分離采集。類似地, Zhang等利用該方法實現(xiàn)了紅細胞與血漿的加速分離。Hou等設(shè)計了一種可以控制液體流動的微流控芯片, 通過不同的管道設(shè)計與流速調(diào)節(jié)改變微流道內(nèi)的流體力學(xué)特征, 進而利用血細胞在大小、形狀及剛?cè)崃W(xué)特性的不同, 從微量血液樣品中分離出了特定的血細胞, 包括瘧疾感染的紅細胞、循環(huán)腫瘤細胞及不同種類的白細胞, 最終達到了檢測的目的。

圖 8 基于慣性效應(yīng)和黏彈性效應(yīng)設(shè)計的微流控裝置用于特定類型血細胞的分離采集。(a)微流道內(nèi)瘧疾感染紅細胞和健康紅細胞的分離; (b)微流道內(nèi)循環(huán)腫瘤細胞、白細胞和紅細胞的分離

1.2.2 通過在微流控通道中施加外加力場驅(qū)動的細胞分離

通過在微流控通道中施加外加力場驅(qū)動細胞分離的方式主要包括介電電泳力驅(qū)動、磁場作用力驅(qū)動、超聲波驅(qū)動等3種。

(1) 介電電泳力驅(qū)動。介電電泳技術(shù)描述的是位于非均勻電場的中性微粒由于介電極化的作用而產(chǎn)生的平移運動。當處于非均勻電場中時, 血細胞產(chǎn)生極化現(xiàn)象, 其表面會產(chǎn)生偶極矩, 進而在介電電泳力的作用下, 向更強的電場強度方向移動(陽性介電電泳)或者更弱的電場強度方向移動(陰性介電電泳)。由于血細胞所受介電電泳力的大小取決于血細胞的大小和形狀、以及懸浮媒介的介電性質(zhì)和黏度特性等因素, 因此在微流控芯片上進行介電電泳可實現(xiàn)血細胞的分離。介電電泳細胞分離技術(shù)具有無需標記、無需表面修飾和特異性高的特點, 因此, 以微流控芯片介電電泳為基礎(chǔ)的分離采集技術(shù)在血細胞分離領(lǐng)域已被廣泛應(yīng)用。例如, Nascimento等利用微流控介電電泳實現(xiàn)了受寄生蟲感染的紅細胞與健康紅細胞的分離采集。當紅細胞受到寄生蟲感染后, 其細胞膜微結(jié)構(gòu)和表面抗原會發(fā)生一定程度的變化, 同時, 細胞膜通透性也會有一定程度的增強, 導(dǎo)致感染紅細胞和健康紅細胞在介電場中所受介電電泳力的方向和大小都有不同, 進而遷移至不同的微通道, 實現(xiàn)分離采集的目的。

(2) 磁場作用力驅(qū)動。對目標血細胞用微型磁珠進行磁性標記, 被磁性標記的血細胞流經(jīng)磁場區(qū)域時, 磁場作用力使目標血細胞偏離原來的運動軌道。不同大小和磁化率的血細胞流經(jīng)梯度磁場時所受磁場作用力不同從而實現(xiàn)分離采集。例如, Karabacak等利用慣性效應(yīng)及磁場效應(yīng)設(shè)計了一種微流控芯片裝置, 成功實現(xiàn)了對純循環(huán)腫瘤細胞的分離富集。這套微流控裝置前半部分的微通道內(nèi)布滿了傾斜的微柱陣列, 尺寸小的紅細胞/血小板和尺寸大的白細胞/癌細胞在微柱陣列中受到慣性升力不同而分離至不同的微通道(圖 9(a))。接下來, 白細胞和癌細胞的懸浮液經(jīng)過中間微通道流經(jīng)磁場區(qū)域, 在磁場作用力和流體驅(qū)動力的共同驅(qū)動下流向不同的收集通道, 從而將低濃度的癌細胞從白細胞中分離出來(圖 9(a))。Zhao等利用磁流體對不同類型細胞的作用力不同設(shè)計了2種微流控裝置(圖 9(b)), 實現(xiàn)了循環(huán)腫瘤細胞和白細胞/紅細胞的分離。另外, 利用磁流體方法可測量紅細胞在磁性介質(zhì)中的懸浮情況, 進而評估紅細胞的變形性能。例如, Tasoglu等將紅細胞浸入溶液里, 然后注入夾在2個磁體中間的毛細管中。磁力從毛細管底部到頂部垂直減小, 因此紅細胞的最終平衡位置由細胞的密度確定。這種方法可以區(qū)分并分離健康和被感染的紅細胞。

圖 9 微流控通道中細胞分離示意圖。(a)~(b)基于慣性升力和磁場效應(yīng)從微量血液樣品中實現(xiàn)腫瘤細胞和血細胞的分離采集; (c)~(d)通過超聲波微流控裝置從血細胞混合液中分離腫瘤細胞

(3) 超聲波驅(qū)動。對通過微通道的流體施加一定角度的聲波, 其產(chǎn)生的壓力可推動懸浮在液體中的顆粒移動。與正常的血細胞相比, 聲波對癌細胞的推力更大, 故可將腫瘤細胞推到單獨的微通道。例如, Ding等人設(shè)計了一個外加表面聲波的微流控裝置實現(xiàn)了循環(huán)腫瘤細胞的分離捕獲。這套微流控裝置的兩端裝有2個產(chǎn)生聲波的傳感器(圖 9(c))。當兩股聲波相遇時, 產(chǎn)生的壓力能推動細胞移動。他們利用此方法從乳腺癌患者的血液中成功檢測到極為罕見的腫瘤細胞。Collins等使用高頻聚焦表面聲波垂直作用于流體, 進而推動流體流動并在微通道中產(chǎn)生流體渦流。他們利用流體渦流形成的渦旋實現(xiàn)了多種不同尺寸顆粒的分離捕獲, 并從紅細胞和癌細胞混合液中成功捕獲了乳腺癌細胞(圖 9(d))?；谖⒘骺爻暡?qū)動的細胞分選具有無需配體、無需標記和生物兼容的特點, 同時, 由于每個細胞僅在不到1 s的時間內(nèi)經(jīng)歷聲波, 因此, 與其他細胞分離捕獲技術(shù)相比, 該技術(shù)顯得更為溫和, 對分離血細胞損傷的風(fēng)險大大降低。

1.3 血細胞機械疲勞損傷

軟物質(zhì)材料會在長期的循環(huán)應(yīng)變作用下發(fā)生損傷和斷裂, 也就是機械疲勞。類似的, 在生物細胞中, 例如紅細胞, 在循環(huán)應(yīng)力的作用下也會產(chǎn)生機械疲勞。Du及其合作者基于介電電泳技術(shù)設(shè)計了一種包含振幅調(diào)制電極的微流控芯片, 研究了循環(huán)機械應(yīng)變下單個紅細胞的機械疲勞損傷行為。實驗結(jié)果表明, 在一定的循環(huán)載荷下, 紅細胞會產(chǎn)生機械疲勞效應(yīng); 同時, 在相同的累積加載時間和相同的最大載荷下, 動態(tài)循環(huán)載荷比靜態(tài)載荷對紅細胞膜的損傷更大。此外, 他們發(fā)現(xiàn)不同的載荷形態(tài)(如方波載荷、擬正弦波載荷等)對紅細胞膜損傷的影響程度也有所不同:與擬正弦波載荷實驗結(jié)果相比, 循環(huán)方波載荷對紅細胞膜機械變形影響更為顯著。他們還發(fā)現(xiàn)機械疲勞效應(yīng)會導(dǎo)致磁滯和能量耗散, 持續(xù)的機械疲勞對血細胞的結(jié)構(gòu)完整性和生物學(xué)功能有著不利影響。這樣的疲勞測試平臺可用來定量表征血液循環(huán)過程中單個血細胞累積的細胞膜損傷, 幫助人們了解血細胞的應(yīng)力波動對其生物力學(xué)特性的影響。

2 總結(jié)及展望

紅細胞變形性能對血流性質(zhì)有重大影響, 它是決定高切率下血液黏率的關(guān)鍵因素。許多血液病變是由于紅細胞變形性能低下導(dǎo)致的。例如, 瘧疾感染紅細胞和貧血癥下鐮狀紅細胞的變形性能會減弱, 不利于紅細胞通過狹窄毛細血管; 遺傳性球形紅細胞增多癥下球形紅細胞由于體表比增加進而使紅細胞很難變形。目前, 人們已發(fā)展一些實驗技術(shù)來研究病變紅細胞的變形性能及生物力學(xué)響應(yīng), 然而, 在單細胞水平研究紅細胞的變形和流動特征仍面臨很大挑戰(zhàn)。近些年來迅速發(fā)展的微流控芯片技術(shù)憑借其特有的優(yōu)勢為健康與疾病中的紅細胞力學(xué)性能研究提供了一個很好的平臺。隨著微流控芯片技術(shù)的不斷發(fā)展, 如何模擬更復(fù)雜的幾何形態(tài)和更逼真的血流微環(huán)境, 把血細胞形狀的動態(tài)變化和各種疾病的病理變化及臨床表現(xiàn)聯(lián)系起來, 將是未來工作的一個重點和難點。

同時, 基于微流控芯片技術(shù)的器官芯片(Organ-on-a-chip)近幾年來發(fā)展迅速, 已經(jīng)實現(xiàn)了體外模擬多種活體細胞、組織及器官微環(huán)境。為適應(yīng)人類器官及血管的復(fù)雜性, 未來的研究需要建立更加復(fù)雜的多器官微流控芯片(Multi-organ-on-a-chip)系統(tǒng), 將不同器官芯片模型應(yīng)用到類似人體的血液循環(huán)環(huán)境中。目前熱門的3D生物打印技術(shù)具有精確的控制能力和個性化特點, 使得"定制"人體組織器官成為可能。通過在芯片上打印特定帶血管的器官, 可以更好地模擬細胞、血管及組織微環(huán)境并建立患者特異化(Patient-Specific)的血管及器官模型, 進而從細胞-組織-器官等不同層面多尺度探索相關(guān)疾病的發(fā)生機制, 并進行更加系統(tǒng)的藥物毒性檢測和藥效評估。

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