引言

微流芯片于20世紀(jì)90年代提出并逐步發(fā)展，利用合理設(shè)計(jì)的微通道，可實(shí)現(xiàn)流體的微調(diào)控，完成反應(yīng)、分離和分析等過程。根據(jù)微通道形式的不同，分為H型、Y型、十字型、共流式、流體聚焦式和臺(tái)階式等。采用微流芯片制備粒徑均一的微球已成為研究的新熱點(diǎn)，所用材料包括海藻酸鈣、殼聚糖/三聚磷酸鈉、丙烯酰胺、明膠、乙基纖維素、水凝膠等，其中具有微流聚焦效應(yīng)的十字型微通道使用最廣泛。對(duì)于固定床層析過程，粒度均一的介質(zhì)可提高分辨率，減少床層壓降。鑒于微流芯片制備微球具有設(shè)備和操作簡(jiǎn)單，微球單分散性好，粒徑可控等優(yōu)勢(shì)，可成為層析微球制備的新方法。

再生纖維素微球具有合適的多孔結(jié)構(gòu)、剛性和機(jī)械強(qiáng)度，以及良好的化學(xué)反應(yīng)特性，可作為生物大分子層析分離的良好基質(zhì)材料。但是，由于纖維素分子內(nèi)和分子間具有很強(qiáng)的氫鍵作用，使得纖維素?zé)o法溶于水和普通有機(jī)溶劑，加工難度大。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)一些離子液體可直接溶解纖維素，濃度可高達(dá)5%以上，其優(yōu)良性能已受到廣泛關(guān)注，成為纖維素‘’綠色‘’加工的新方法。纖維素微球制備主要有噴射法和懸浮法兩類。對(duì)于噴射法，由合適的噴嘴將纖維素或其衍生物的溶液噴射到惰性介質(zhì)或空氣中分散，制得微球的粒徑比較均勻，但設(shè)備要求高。懸浮分散法將纖維素溶液分散懸浮于不相溶的惰性介質(zhì)中，再生形成微球。由于液滴懸浮分散難以均一，微球的粒徑分布比較寬，需要進(jìn)一步篩分，以得到合適粒徑的微球，目前常用多糖介質(zhì)多采用懸浮分散法制備。以離子液體[BMIM]CI為溶劑，采用反相懸浮法，已成功制備了纖維素微球，但粒徑分布較寬，主要用于擴(kuò)張床吸附分離。

針對(duì)纖維素溶液黏度較高的特性，本文選用十字型微通道，采用離子液體1-乙基-3-甲基咪唑甲基磷酸[EMIM]MP直接溶解微晶纖維素，以纖維素溶液為水相，葵花籽油為油相，通過十字型微通道的聚焦分散作用，得到粒徑均一的微液滴，固化成纖維素微球，進(jìn)一步偶聯(lián)DEAE配基作為離子交換介質(zhì)，為研制新型纖維素層析介質(zhì)打下基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1主要材料

微晶纖維素，上海恒信化學(xué)試劑有限公司，聚合度為250左右；1-乙基-3-甲基咪唑甲基磷酸，[EMIM]MP，法國(guó)Solvionic公司；金龍魚葵花籽油，豐益貿(mào)易有限公司；牛血清白蛋白（BSA），分子量67*10 3公司；鹽酸2-氯三乙胺；DEAE SeoharoseFF；Span和無(wú)水乙醇，市售分析純。

1.2纖維素微球制備

纖維素微球制備一般分為溶解、分散、固化、再生和后處理五個(gè)過程。由于多數(shù)離子液體溶解纖維素需要較高溫度（80-90攝氏度），而有機(jī)材料制成的微流芯片在高溫下容易變形，因此本文選用Fukaya等報(bào)道的離子液體[EMIM]MP，可在25攝氏度、5h溶解5%微晶纖維素（DP=250）。

纖維素微球的制備裝置見圖1。內(nèi)有十字型微通道的微流芯片由臺(tái)灣成功大學(xué)林裕誠(chéng)教授惠贈(zèng)，主要包括以聚甲基丙烯酸甲酯為材質(zhì)的三層平板，中間層利用激光雕蝕形成十字型微通道，上層是水相和油相入口，下層是微液滴出口。在前期研究基礎(chǔ)上，選擇45攝氏度的恒溫條件，以添加Span85的葵花籽油為油相，以合適濃度的纖維素-離子液體溶液為水相，通過十字型微通道將纖維素溶液剪切分散成粒徑均一的微液滴，滴入水中，攪拌促使纖維素再生，實(shí)現(xiàn)纖維素微球的固化成形。最后，用去離子水浸泡沖洗纖維素微球，去除殘余的離子液體。

圖1微流芯片和纖維素微球制備示意圖

1.3PHP離子交換介質(zhì)的制備

DEAE配基偶聯(lián)分為兩步；先將纖維素微球浸入強(qiáng)堿中堿化，然后加入鹽酸；:氯三乙胺，在適當(dāng)溫度下偶聯(lián)形成陰離子交換介質(zhì)。采用文獻(xiàn)方法，稱取2g抽干介質(zhì)于25ml三角瓶中，加入4ml、5mol*L-1的鹽酸2-氯三乙胺溶液，于60攝氏度恒溫水浴搖床中預(yù)熱10min，取4ml、6mol*L-1的NaOH加入錐形瓶中，150r*min-1搖床反應(yīng)2h；反應(yīng)結(jié)束后迅速冷卻，用大量去離子水清洗，得到偶聯(lián)DEAE的纖維素層析介質(zhì)，保存于20%乙醇中備用。

1.4液滴和微球粒徑分析

1.4.1微液滴直徑

采用顯微鏡法，用帶有標(biāo)尺的光學(xué)顯微鏡,觀察微液滴，利用Image-proplus 5.0軟件隨機(jī)分析150個(gè)液滴的直徑，計(jì)算平均直徑8和分布系數(shù)CV

式中di為液滴的直徑，n為液滴數(shù)。

1.4.2微球粒徑分布

微球粒徑分布采用LS-230 Coulter激光粒徑儀分析。

1.5微球表觀形態(tài)

用濃度梯度逐步增大的乙醇溶液替換出微球中的水分，采用co2臨界點(diǎn)干燥儀干燥，通過掃描電鏡觀察微球的表面形態(tài)。

1.6微球基本物性

微球的濕真密度。含水率、孔度、孔容等基本物性參照文獻(xiàn)方法測(cè)定。

1.7離子交換容量

離子交換容量指單位質(zhì)量介質(zhì)中可交換的酸性或堿性基團(tuán)的含量，本文采用AgNO3滴定法測(cè)定陰離子交換配基DEAE偶聯(lián)量。先使DEAE配基與C1-充分結(jié)合，然后加入過量Na2SO4溶液，用SO4置換出C1-，最后滴定測(cè)定置換出的C1-，計(jì)算離子交換容量。

1.8靜態(tài)吸附平衡

以BSA為模型吸附蛋白考察靜態(tài)吸附平衡。將介質(zhì)用緩沖液。(平衡+);G3；抽濾，稱取約0.03g置于2ml離心管中，加入1ml不同濃度的BSA溶液；將離心管置于恒溫混勻儀中，25攝氏度下1000r*min-1振蕩3h；達(dá)到平衡后，取上清液280nm;測(cè)定BSA濃度。根據(jù)物料平衡計(jì)算吸附容量，本文以單位質(zhì)量介質(zhì)吸附[/B的質(zhì)量來(lái)表示吸附容量。采用Langmuir吸附等溫式，擬合得到其飽和吸附容量和解離常數(shù)。

式中Q為平衡吸附容量，mg*（g介質(zhì)）；為吸附平衡后液相的蛋白濃度為

飽和吸附容量"; 為解離常數(shù)";

圖2 2%纖維素制備微球的電鏡分析照片

1.9吸附動(dòng)力學(xué)

用緩沖液配制0.5mg*ml-1BSA溶液，取100ml置于三角瓶中，磁力攪拌器攪拌，由蠕動(dòng)泵驅(qū)動(dòng)，溶液經(jīng)0.22um濾膜過濾，再經(jīng)紫外檢測(cè)儀，循環(huán)回到三角瓶。當(dāng)紫外檢測(cè)儀基線穩(wěn)定后，將0.356g抽干介質(zhì)加入到蛋白溶液中，紫外檢測(cè)儀實(shí)時(shí)檢測(cè)溶液中蛋白濃度的變化，繪制隨時(shí)間變化的吸附動(dòng)力學(xué)曲線。

2結(jié)果與討論

2.1纖維素濃度的影響

纖維素濃度是纖維素微球制備的關(guān)鍵因素，不僅決定離子液體溶解纖維素的時(shí)間，還影響纖維素:離子液體溶液的黏度，從而影響微通道內(nèi)的流型和微液滴的形成。隨著纖維素濃度的增加，纖維素:離子液體溶液的黏度顯著增加。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過高黏度的纖維素溶液不利于形成粒徑均一的微液滴。此外，纖維素濃度過高將造成微球的孔隙率較低，影響生物大分子的吸附性能。

考察了5個(gè)纖維素濃度，以纖維素:離子液體溶液為水相，葵花籽油為油相，控制合適的油相和水相流速，可以形成微液滴，固化成纖維素微球。微球經(jīng)清洗和干燥后，用掃描電鏡觀察表面形貌，結(jié)果見圖；。比較發(fā)現(xiàn)；?纖維素濃度制備微球的球形度較好，具有典型的多孔結(jié)構(gòu)，微球表面和內(nèi)部孔道分布較均勻，與常用瓊脂糖凝膠的結(jié)構(gòu)十分相似，故后續(xù)研究選取2%纖維素濃度。

2.2分散劑的影響

選用Span85作為油相分散劑，考察不同Span85濃度對(duì)微液滴直徑和粒徑分布的影響，結(jié)果見圖3。未添加Span85時(shí)，纖維素溶液分散不好，液滴形成不穩(wěn)定，極易破裂；當(dāng)Span85濃度較低，液滴大小不均勻，粒徑分布較寬；當(dāng)Span85濃度在,5%-7%之間，液滴較小，粒徑分布較窄；隨Span85濃度進(jìn)一步增大，微液滴粒徑和粒徑分布都有所增大。選定Span85添加量為5%-6%。

圖3 Span85添加量對(duì)微液滴粒徑和,$值的影響

2.3油水兩相流速的影響

調(diào)節(jié)合適的水相流速、油相流速以及油相)水相流速比是控制微液滴大小的有效手段。結(jié)合前期研究，固定4個(gè)油相流速和油相，考察了不同水相流速!P和油相)水相流速比對(duì)微液滴直徑和粒徑分布的影響，結(jié)果見圖4。

圖4油水兩相流速對(duì)微液滴粒徑和,$值的影響

從圖中可以看出，油相流速相同時(shí)，隨著水相流速增大，形成的液滴直徑也逐漸增大；在不同的油相流速下，液滴直徑增大的幅度不同，油相流速越小，液滴直徑增大越快。水相流速相同時(shí)，隨著油相流速增大，即增加油相)水相流速比，導(dǎo)致微液滴粒徑的減小。當(dāng)水相流速為5ul*min-1時(shí)，油相流速在200-400ul*min-1。(;G3>*范圍內(nèi)均可得到直徑約100ul的液滴，但是油相)水相流速比過大，過程較難控制，且造成油相浪費(fèi)。比較,$值發(fā)現(xiàn)，基本都在0.1-0.25之間，特別是油相流速為200ul*min-1時(shí)，CV值基本在0.15以下，微液滴粒徑分布均一。

綜合考慮微液滴直徑、CV值、制備時(shí)間和成本等因素，選擇油相流速200ul*min-1，水相流速6ul*min-1為最佳條件，可形成粒徑100um左右、分布較均一的微液滴。圖5為纖維素微液滴的顯微鏡照片，可見液滴直徑分布比較均一。

圖5 纖維素微液滴的顯微鏡照片

2.4纖維素微球的理化性質(zhì)

采用2%纖維素溶液為水相，添加5%Span85的葵花籽油為油相，水相流速6ul*min-1，油相流速200ul*min-1的優(yōu)化條件下，十字型微通道內(nèi)形成微液滴，固化成球，得到粒徑均一的纖維素微球。微球的基本性質(zhì)見表1，并與商品化纖維素介質(zhì)和常用瓊脂糖介質(zhì)進(jìn)行比較。結(jié)果表明，本文制備纖維素微球的濕真密度比略小，含水率、孔度和孔容均較大。孔度較高與制備中纖維素濃度和聚合度較低有關(guān)，較大的孔道空間有利于生物大分子的傳質(zhì)分離。

纖維素微球的粒徑分布如圖6所示，體均粒徑見表1。可以看出，本文制備微球的平均粒徑與常用介質(zhì)十分接近，均為100um左右。未經(jīng)篩分的微球粒徑分布與商用介質(zhì)相似，分布對(duì)稱性較好，體現(xiàn)出微通道制備粒徑均一微球的優(yōu)勢(shì)。

2.5纖維素離子交換介質(zhì)及其吸附性能

以纖維素微球?yàn)榛|(zhì)，偶聯(lián)上陰離子交換基團(tuán)DEAE，得到了DEAE陰離子交換介質(zhì)，命名為Cell-MC-DEAE，測(cè)得離子交換容量為123.3umol*g-1。與課題組前期用反向懸浮法制得的纖維素微球介質(zhì)相比較小，也低于常用的商業(yè)化介質(zhì)DEA和DEAE見表2DEAE介質(zhì)對(duì)[/B的吸附等溫線如圖7所示，并以Y43=;1G2等溫式擬合吸附等溫線。由圖可見，式3可以很好地?cái)M合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，得到的飽合吸附容量!;和解離常數(shù)、N見表2。

表1不同!PHP離子交換介質(zhì)的吸附性能比較

圖6 纖維素微球和商用介質(zhì)的粒徑分布比較

Cell-MC-DEAE的飽合吸附容量為220mg*g-1，相比于施霏制備的介質(zhì)，雖然離子交換容量較小，但吸附量較大。原因可能是施霏所用的纖維素溶液濃度高，而本文纖維素濃度僅為2%，形成纖維素微球的內(nèi)部孔徑較大，生物大分子的有效吸附表面較高。圖7還比較了本文制備介質(zhì)和商用介質(zhì)DEAESwpharose FF、DEACell-lulineA-500的靜態(tài)吸附平衡，可以看出DEACell-luline的吸附容量較大，大約是DEAESwpharose FF介質(zhì)的兩倍，略高于DEAE,6。。1QG36B:@))介質(zhì)，體現(xiàn)出高吸附容量的特色。此外，,6。。:U,:DEAE的、N較小，即在低蛋白濃度下具有較高的吸附容量，有利于蛋白質(zhì)的吸附分離。

DEAESwpharose FF介質(zhì)對(duì)[/B的吸附動(dòng)力學(xué)曲線如圖C所示，并與DEAE/6JL42%E655和A.:B.,6。。1QG36B:@))介質(zhì)比較。采用孔擴(kuò)散模型擬合吸附動(dòng)力學(xué)曲線，得到孔擴(kuò)散系數(shù)，J和有效擴(kuò)散系數(shù)，6見表；。比較發(fā)現(xiàn)，雖然,6。。:U,:A.:B.介質(zhì)的離子交換容量略低于DEAE/6JL42%E655，但有效擴(kuò)散系數(shù)是DEAE/6JL42%E655的；倍以上；,6。。:U,:DEAE的孔擴(kuò)散系數(shù)與,6。。1QG36B:@))相當(dāng)。結(jié)果表明，本文制備纖維素介質(zhì)具有較大孔徑，有利于生物大分子的孔內(nèi)傳質(zhì)和吸附分離。

圖7 BSA吸附等溫線及與常用介質(zhì)比較

圖8不同介質(zhì)的[/B吸附動(dòng)力學(xué)比較

3結(jié)論

以離子液體[EMIM]MP直接溶解纖維素作為水相，在45攝氏度恒溫條件下，以十字型微通道對(duì)纖維素溶液進(jìn)行分散，得到粒徑均一的纖維素微液滴，固化再生，得到纖維素微球。確定了合適的制備條件%纖維素濃度為2%，油相添加5%Span85油、水兩相流速分別為200ul*min-1和6ul*min-1，制得微球球形度好，粒徑較均一，且具有較高孔度和孔容。微球偶聯(lián)DEAE配基，制得離子交換層析介質(zhì)，離子交換容量為123.3umol*g-1，飽和吸附容量Qm達(dá)220mg*g-1，有效擴(kuò)散系數(shù)De為1.8*10-11m2*s-1，體現(xiàn)出良好的層析分離應(yīng)用前景。

文獻(xiàn)來(lái)源化工學(xué)報(bào)DOI：10.3969/j.issn.0438-1157.2013.02.036作者：童芳麗，林東強(qiáng)，劉川，賀軍賢，姚善涇

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